Коралловые рифы быстро исчезают в результате увеличения выброса углекислого газа, использования цианида для вылова рыбы и эвтрофикации. И наоборот, рынок рифовой аквариумистики переживает рост спроса, несмотря на то, что многие аквариумисты не знакомы с химией морской воды и физиологией кораллов. В данном исследовании, состояние здоровья трех видов рифообразующих кораллов (Caulastrea furcata, Pavona decussata и Pocillopora damicornis) было проанализировано при помощи PAM-флюорометрии в условиях неблагоприятной среды. Уровень содержания кальция, щелочи и pH изменялись таким образом, чтобы они соответствовали условиям окисления океана и максимально низким и высоким показателям, получаемым в результате неправильного дозирования в аквариуме. Среди исследованных видов, на максимальный потенциал квантового выхода (Fv/Fm) в значительной степени влияли неблагоприятные условия. В частности, ухудшение состояния кораллов наблюдалось при повышении содержания щелочи и уменьшении концентрации кальция. Более того, кораллы не продемонстрировали негативной реакции по Fv/Fm при низком показателе pH. 

Герматипные (рифообразующие) кораллы быстро исчезают вследствие подводной выемки грунта, использования цианида в рыбной ловле, эвтрофикации, чрезмерного вылова рыб и повышения температуры поверхности моря (Edinger et al. 1998, Hughes et al. 2003, Marubini and Thake 1999). Однако, чтобы полностью понять прямое биохимическое воздействие на кораллы, необходимо знать анатомию и физиологию кораллов. 

Все рифообразующие кораллы состоят из арагонитового скелета, который представляет собой кристаллизированную форму карбоната кальция (CaCO3) (Barnes 1970). С учетом постоянного увеличения содержания углекислого газа в атмосфере, в океане увеличивается содержание угольной кислоты. Угольная кислота сдерживает обмен ионов водорода, который, в свою очередь, сдерживает выработку карбоната кальция и снижает pH (Marubini and Atkinson 1999). Без выработки карбоната кальция скелеты кораллов слабеют и со временем полностью разрушаются (Kleypas and Langdon 2000). Этот процесс многие связывают с недостаточным восстановлением коралловых рифов, пострадавших вследствие использования динамита и цианита в рыбной ловле (Hilbertz 1981 and Jones et al. 1999). 

Зооксантеллы (Zooxanthellae) (Frudenthal, 1962) вступают в мутуалистические симбиотические отношения со своими рифообразующими «хозяевами»; в обмен на место обитания и питательные вещества, зооксантеллы обеспечивают кораллы фотохимически-полезной энергией, внося существенный вклад в общее количество энергии кораллов (Knowlton and Rohwer 2003 and Muscatine and Porter 1977). По мере того, когда качество воды достигает неблагоприятных показателей или температура становится слишком высокой, коралл-«хозяин» прерывает отношения с зооксантеллами, оставляя, или высвобождая, зооксантеллы из своих тканей (процесс известен как «обесцвечивание»). На протяжении многих лет процесс обесцвечивания кораллов усиливался и стал основной причиной гибели рифов, включая самый большой риф в мире, Большой Барьерный Риф (Brown 1997 and McCowan et al. 2012). В аквариумах обесцвечивание наблюдается, также как и на естественных рифах, в случае несоответствующего качества воды или неподходящей температуры (Donowitz 2002). 

Биологическое разнообразие среды коралловых рифов стало причиной повышенного интереса к тропическим рифовым аквариумам во всем мире (Jones et al. 1999). Благодаря технологическому прогрессу в аквариумистике (например, генераторы волн, светильники и системы механической фильтрации), в настоящее время рифовые аквариумы значительно легче содержать и обслуживать. Благодаря прогрессу механического компонента аквариумистики, наблюдается прогресс и в очистке воды. Компании-производители, такие как Seachem и Kent Marine, улучшают средства химической очистки для поддержания оптимального качества воды, что немаловажно, прежде всего, для здоровья кораллов. Наиболее распространенные параметры качества воды, которые проверяются и корректируются в аквариумах: щелочность, кальций и pH (Donowitz 2002). Чтобы кораллы хорошо себя чувствовали, необходимо поддерживать эти параметры на определенных уровнях. Для естественной морской воды характерны следующие показатели: щелочность - 2.5 meq/L, pH - 8.2 и кальций - 410 ppm (Holmes-Farley 2005). В рифовых аквариумах показатели этих параметров выше: щелочность=3.0-3.5 meq/L, pH=8.2-8.4 и кальций=420-450 ppm. Поддержание этих параметров обеспечивается посредством «дозирования», которое зачастую состоит из двух этапов: 1) раствор хлорида кальция с добавлением микроэлементов и 2) раствор бикарбоната и карбоната (щелочь). При неправильном дозировании, эти параметры способны привести к перенасыщению, соответственно, увеличивая вероятность выпадения CaCO3 в осадок, процесс известный как «обвал системы» (Holmes-Farley 2005). Выпадение CaCO3 в осадок оказывает негативное воздействие на кораллы в закрытых системах, таких как рифовые аквариумы. 

Для оценки состояния кораллов, в настоящее время доступны лишь несколько методов, но они считаются дорогостоящими, кроме того, вероятность ошибки при использовании таких методов весьма велика. Литтман и др. (Littman et al., 2008) сравнивает точность гемоцитометра с проточным цитометром, измеряя плотность свободно живущих зооксантелл. Многие начинают использовать метод гемоцитометрии, который предполагает снятие тканей с коралла, помещение их в раствор формалина, а затем подсчет количества клеток зооксантелл, отделившихся от тканей коралла (Suwa et al. 2008). 

Однако, в начале 1990-х годов появился новый, менее «агрессивный» метод – флюорометрия хлорофилла PAM (Jones et al 1999, Suwa et al. 2008 и Kramer et al. 2012). Этот метод помогает измерить максимальный потенциал квантового выхода (Fv/Fm), который представляет собой разницу минимальной и максимальной флюоресценции, разделенную на максимальную флюоресценцию. Если кратко, то флюорометр измеряет, насколько эффективно зооксантеллы конвертируют свет в фотохимически-полезную энергию для коралла (Jones et al 1999, Suwa et al. 2008, Kramer et al. 2012, McCowen et al. 2012 и Zartler 2012). Этот метод можно применять и в домашних аквариумах, используя менее дорогой и меньшего размера Heinz Walz Jr. PAM-флюорометр хлорофилла (Zartler 2012). 

В рамках данного эксперимента я проанализировала состояние здоровья трех видов рифообразующих кораллов (Pavona decussata, Pocillopora damicornis и Caulastrea furcata) при помощи PAM-флюорометрии в неблагоприятных условиях. Содержание кальция, щелочности и pH были изменены так, чтобы соответствовать (1) ситуации подкисления океана и (2) чрезмерно низким и чрезмерно высоким уровням, получаемым в аквариумах в случае неправильных дозировок. Цель данного исследования – изучить воздействие низкого (или неблагоприятного) качества воды на рифообразующие кораллы в условиях искусственной среды и понять возможное влияние окисления океана на эти кораллы. 

Семь 5-галлонных аквариумов были расположены на расстоянии 7 см друг от друга на тумбе в биологической лаборатории Тихоокеанского Университета Аляски (APU). Каждый аквариум был помечен в соответствии со специальной экспериментальной процедурой (Таблица 1). С целью проведения биологической фильтрации в каждый аквариум был помещен пластиковый контейнер с живым песком и амфиподами, предварительно выращенными в созревшем аквариуме. Для поддержания правильной циркуляции живой песок был насыщен кислородом при помощи компрессора. Дополнительно, в каждую систему были помещены навесные фильтры с фильтрующей губкой и активированным углем для механической и химической фильтрации. До начала эксперимента качество воды поддерживалось на уровне естественной морской воды при помощи еженедельных подмен 10% от объема воды с использованием соли Red Sea Salt. 

Фраги трех рифообразующих кораллов, C. furcata, P. decussata и P. damicornis, были получены при помощи фрезы от родительских колоний, длительное время обитавших в системе аквариумной лаборатории APU. Был подготовлен двадцать один фрагмент каждого вида (средняя длина составила 5 см). Индивидуальные фрагменты были отрезаны по видам следующим образом: 2-3 полипа для каждого C. furcata, 1-2 "среза" для каждого P. decussata и 2-3 ветви для каждого P. damicornis (Изображение 1). По мере того, как фраги были готовы, каждый набор из полипов, срезов и ветвей был расположен на 3-сантиметровые керамические плашки и прикреплен при помощи цианоакрилового клея. Далее фраги кораллов были равномерно распределены по семи различным экспериментальным аквариумам (по три фрагмента каждого вида на каждый аквариум) и акклиматизированы. Все аквариумы вызревали в течение 2 месяцев до проведения акклиматизации. 

Изображение 1. Фрагменты трех видов кораллов: C. furcata (слева), P. decussata (по центру) и P. damicornis (справа). 

33% раствор соляной кислоты (соляной кислоты, HCl_aq) использовался для снижения и поддержания низкого уровня pH, равного 7.9 в системе "Низкий уровень pH". Показатель был достигнут посредством дозирования 0.25 мл HCl_aq каждые 10 минут в течение ~2-3 часов, 3 раза в неделю в течение одной недели до взятия проб для флюорометрии. В системе "Высокий уровень pH" проводилось дозирование 42% раствора известковой воды (кальквассера) и поддерживался высокий уровень pH, равный 8.35-8.40. Процедура дозирования была такая же, как и в системе с низким уровнем pH. 

В системе "Низкий уровень щелочности" поддерживался уровень 1.5 meq/L посредством дозирования 0.625 грамм добавки Seachem Reef Builder Calcium по 4 раза каждые 10 минут, 1-3 раза в неделю, в зависимости от результатов дозирования на предыдущей неделе. Кальциевая добавка, Seachem Reef Carbonate, использовалась для уменьшения щелочности по причине негативной взаимосвязи двух параметров в рифовых аквариумах (Seachem Laboratories Inc 2004. Для повышения содержания щелочности и поддержания ее высокой концентрации 7.0 meq/L, в системе «Высокий уровень щелочи» использовалась 0.6 грамма добавки Seachem Reef Carbonate Alkalinity: 4 раза каждые 10 минут, 3 раза в неделю. 

В системе "Низкий уровень кальция" поддерживалось содержание кальция на уровне 350 ppm посредством дозирования 0.6 грамма добавки Seachem Reef Carbonate по 4 раза, каждые 10 минут, 1-3 раза в неделю (в зависимости от результатов качества воды на предыдущей неделе). В системе "Высокий уровень кальция" поддерживался уровень кальция в пределах 500- 600 ppm при помощи дозирования 0.625 грамм добавки Seachem Reef Builder calcium, по 4 раза каждые 10 минут, 3 раза в неделю. 

Качество воды проверялось при помощи теста Seachem Marine Basic (Seachem Laboratories Inc., 2004), который измеряет следующие параметры: pH, щелочь (meq/L), нитриты и нитраты (mg/L), общее содержание аммиака (или ионизированного) и содержание свободного аммиака (mg/L). Оценивались все выше указанные параметры. Как правило, содержание нитратов и нитритов возрастало при добавлении в систему чрезмерного количества питательных веществ, что могло стать стрессовым фактором для кораллов. Необходимо было поддерживать их содержание на уровне 0.00 mg/L на протяжении всего эксперимента (Hughes et al. 2003). Кроме того, аммиак токсичен в аквариуме, поэтому уровень его содержания необходимо поддерживать равным 0.00 mg/L (Seachem Laboratories Inc. 2004). Во всех аквариумах поддерживалась температура 26°C. Соленость измерялась ежедневно при помощи оптического рефрактометра; во всех системах соленость поддерживалась на уровне 33-34 ppt на протяжении всего эксперимента. 

Отбор образцов для флюорометрии проводился в соответствии с методом Крамера и др. (Kramer et al., 2013). Флюорометр хлорофилла Heinz Walz Jr-PAM (Pulse Amplitude Modulated) с импульсом 450 нм использовался через 100-сантиметровый, 1.5 мм в диаметре, волоконно-оптический кабель для получения значений максимального потенциала квантового выхода. Замеры проводились параллельно на расстоянии не более 1 мм от ценосарка кораллов (ткань, соединяющая полипы). При расчетах импульса насыщения использовалась программа PAM WinControl-3. 

Множественная регрессия использовалась для определения зависимости максимального потенциала квантового выхода от изменения уровня pH, щелочи и кальция с воздействием на виды кораллов. В связи с необъяснимой гибелью, девять фрагов P. damicornis не учитываются в данном анализе. Все данные были проанализированы при помощи программы "R" (R Core Team 2012). 

Была обнаружена значительная разница в максимальном потенциале квантового выхода по pH (F = (3, 328) 15.1, p-value < 0.001) между видами, см. Изображение 2a; однако, с уровнем рН - слабая взаимосвязь (r2 = 0.121), см. Изображение 3b. C. furcata и P. damicornis продемонстрировали существенные различия (p-value < 0.05), а P. decussata не продемонстрировал существенного отличия (p-value = 0.143). Среди всех видов отмечается пиковое/максимальное значение Fv/Fm при рН около 8.2. 

Максимальный потенциал квантового выхода продемонстрировал реакцию видов на изменение щелочности (F = (3, 328) 43.1, p-value < 0.001), см. Изображение 2b. Также как в случае с pH, наблюдалась слабая взаимосвязь (r2 = 0.283) (Изображение 3a). Дополнительно, C. furcata и P.damicornis продемонстрировали существенные отличия (p-values < 0.001) в Fv/Fm, тогда как для P. decussata такой разницы не наблюдалось (p-value = 0.107). 

У трех видов наблюдалась значительная разница в максимуме потенциала квантового выхода в результате обработки кальцием (F = (3, 319) 17.0, p-value < 0.001), см. Изображение 2c. Однако, также как в ситуации с pH и щелочью, отмечалась слабая взаимосвязь (r2 = 0.134), см. Изображение 3c. В частности, существенное влияние наблюдалось у C. furcata и P. damicornis (p-values < 0.001). И снова, кораллы P. decussata не испытали серьезного воздействия (p-value = 0.124). Заметный минимальный порог примерно в 375 ppm отмечался у всех видов. 

Изображение 2. Общий обзор изменений максимального потенциала квантового выхода по всем параметрам (высокие и низкие показатели) по сравнению с контрольным аквариумом.
Цвет морской волны - C. furcata, зеленый цвет - P. decussate и коричневый цвет - P. damicornis.
Каждый столбец – в пределах 2 стандартных ошибок среднего. 

В рамках исследования наблюдалось изменение состояния кораллов при нахождении в условиях с неблагоприятными уровнями рН, щелочи и кальция. Однако, необходимо отметить, что кораллы P. decussata не продемонстрировали существенных изменений при любых показателях всех трех параметров, что свидетельствует о том, что реакция этих кораллов на неблагоприятные условия отличается. Например, P. decussata продемонстрировали немного более высокий Fv/Fm в ситуации с высоким уровнем кальция по сравнению с C. furcata и P. damicornis. Все виды негативно реагировали на низкую концентрацию кальция (300-350 ppm) с очевидным минимальным порогом около 375 ppm. Этот пороговый показатель необходимо учитывать при содержании аквариумов. 

Зачастую с целью поддержания здоровья кораллов аквариумисты поддерживают повышенные уровни pH, щелочи и кальция. В данном исследовании повышенное содержание этих параметров привело к снижению фотосинтетической эффективности (Fv/Fm), что свидетельствует об ухудшении состояния кораллов в целом. Кроме того, отмечалось также незначительное ухудшение состояния кораллов при повышении значений параметров в пределах рекомендуемых показателей. Подобное воздействие необходимо учитывать при дозировании в закрытых системах, поскольку кораллы лучше всего себя чувствуют при низших из рекомендуемых показателей. 

Изображение 3. Изменение максимального потенциала квантового выхода при изменении уровней pH, щелочи и кальция.
Заштрихованные столбцы - рекомендуемые для кораллов показатели.
При интерпретации результатов необходимо учитывать положительную взаимосвязь щелочи и pH и негативную взаимосвязь щелочи и кальция. 

Несмотря на то, что при разных уровнях рН в состоянии кораллов не наблюдалось каких-либо существенных изменений, необходимо отметить, что угольная кислота использовалась вместо углекислого газа. При изменении уровня pH не отмечалось общего увеличения содержания угольной кислоты, как видно из графика, в результате изоляции углекислого газа. Как известно, уменьшение уровня pH приводит к снижению общей кальцификации рифообразующих кораллов вследствие уменьшения щелочности; однако, в процессе данного исследования не было отмечено значительных изменений фотохимической эффективности. Важно, что отображенные на графике уровни pH (например, 7.9) не оказывают существенного воздействия на фотохимию зооксантелл. Соответственно, чтобы точно прогнозировать изменения в динамике популяций вследствие окисления океана, необходимо тщательно изучить взаимоотношения между зооксантеллами и их кораллами-«хозяевами». 

Как продемонстрировал Зартлер (Zartler, 2012), отдельные виды кораллов по-разному реагируют на изменения температуры в пределах рекомендуемых показателей. Точно также, данное исследование показывает, что различные виды по-разному реагируют на изменения pH, щелочности и кальция. Например, P. decussata и C. furcata - легко адаптирующиеся кораллы, которые демонстрируют незначительную негативную реакцию в условиях неблагоприятного качества воды, а значит, могут считаться идеальными кораллами для начинающих. Тогда как у P. damicornis пределы переносимости меньше, соответственно, в случае передозировки воздействие на эти кораллы будет сильнее. Данная информация может использоваться при определении опыта аквариумистов в случае содержания отдельных видов (легкий/средний/сложный в содержании) и должна учитываться при разработке процедур дозирования для аквариумов. 

Таблица 1. Экспериментальные аквариумы и состояние параметров. Заданное значение параметра – прогнозируемое значение, среднее значение – средний показатель фактических значений. Добавка – добавки, использовавшиеся для достижения среднего значения параметра. Аквариум 7 – контрольный аквариум с оптимальным (естественным) качеством воды, которое достигалось посредством частичных подмен воды без добавок. 

Аквариум	Параметр	Параметр заданное значение	Параметр среднее значение	Добавка
1	Высокий pH	8,7	8,28	Кальквассер
2	Низкий pH	7,7	8,07	Соляная кислота
3	Высокая щелочность	5.0-8.0 meq/L	4.9 meq/L	Seachem's Alkalinity
4	Низкая щелочность	~1.0 meq/L	2.0 meq/L	Seachem's Alkalinity
5	Высокий кальций	500-800 ppm	530 ppm	Seachem's Alkalinity
6	Низкий кальций	250-300 ppm	386 ppm	Seachem's Alkalinity
7	Эталон (контрольный аквариум)	Оптимальный	-	Нет