Авторы: Робин де Врайс (a*), Тим Уиджгерде (b*), Майкл Латервиер (c)

a. HZ University of Applied Sciences, 4382 NW Vlissingen, The Netherlands, www.hz.nl/en
b. Coral Publications, 3526 JS Utrecht, The Netherlands, www.coralpublications.com
c. Blue Linked, 2728 PD Zoetermeer, The Netherlands, www.bluelinked.eu
*Авторы внесли равноценный вклад в данное исследование

Резюме

В связи с высокой коммерческой ценностью, живые камни – многообещающий кандидат для искусственного культивирования. Задача непростая, потому что наши знания о процессе выращивания живых камней в искусственно созданных условиях весьма ограничены. Данное предварительное исследование нацелено на изучение влияния предварительной обработки и освещенности на рост корковых кораллиновых водорослей (далее ККВ), желательной группы бентических отвердевающих (или корковых) водорослей. Два типа камней (изначально лишенные водорослей («голые») коралловые камни и камни, обрабатывавшиеся в течение 12 недель под слабым освещением) были помещены в 15 000-литровую рециркуляционную систему с двумя вариантами освещения (PAR 80 и 180 µmol m^-2 s^-1); в результате было получено 4 варианта обработки камней (N=10 камней для каждого вида обработки). Рост розовых и красных ККВ отслеживался в течение 9 недель. В целом, розовые ККВ росли быстрее, чем красные кораллиновые водоросли, с показателями 4.31-10.44% в сравнении с 2.45-4.56% покрова по прошествии 9 недель соответственно. Розовые ККВ росли быстрее на необработанных камнях; по прошествии 9 недель розовые ККВ продемонстрировали большую площадь покрова и размер колоний на изначально лишенных какого-либо покрова камнях по сравнению с обработанными камнями. И наоборот, красные ККВ продемонстрировали большую площадь покрова и плотность колоний на обработанных камнях. Несмотря на тот факт, что более высокая плотность колоний и розовых, и красных ККВ была получена при более интенсивном освещении, не было доказано влияние освещения на площадь покрова корковых кораллиновых водорослей. Более того, размер колоний красных ККВ был больше при самом слабом освещении для обоих видов камней. Подобные результаты позволяют предположить, что розовые ККВ – «пионеры», колонизирующие лишенные какой-либо растительности «голые камни» быстрее, чем камни с биопленкой. С другой стороны, красные ККВ, судя по всему, предпочитают биологически обработанные поверхности, кроме того, им требуется больше времени для роста. Поскольку освещение не повлияло на площадь покрова ККВ, разведение живых камней в искусственных условиях будет более экономичным при низкой освещенности. Результаты нашего исследования проливают свет на культивирование живых камней в условиях аквариума, что лишний раз способствует поддержанию экологических инициатив.

Введение

В настоящее время живые камни пользуются большим спросом для домашних и общественных аквариумов, что в перспективе может сказаться на коралловых рифах. Соответственно, в связи с высокой коммерческой ценностью живые камни – многообещающий кандидат для искусственного разведения. В случае местного культивирования живых камней, в качестве дополнительных преимуществ можно выделить уменьшение транспортных расходов и влияния CO2. Задача непростая, потому что наши знания о культивировании живых камней в искусственных условиях весьма ограничены. Например, до сих пор неясно, какие факторы влияют на рост на живых камнях полезных и востребованных отвердевающих водорослей, известных как корковые кораллиновые водоросли (crustose coralline algae, ККВ). Именно благодаря этим корковым кораллиновым водорослям живые камни становятся привлекательного фиолетового, красного и розового цвета, что является ведущим фактором определения их рыночной стоимости (Wabnitz et al. 2003). Кроме того, ККВ играют важную роль в оседании личинок беспозвоночных, таких как планулы кораллов (Negri et al. 2001), и влияют на процесс рифообразования (Björk et al. 1995; Johnson 2014). Нам известно, что качество воды и освещение являются основными факторами роста ККВ (Björk et al. 1995; Belliveau and Paul 2002; Chisholm 2003), но при этом очень мало информации о влиянии типа субстрата на рост ККВ.

Целью данного предварительного исследования стало изучение влияния предварительной обработки и освещенности камней на рост корковых кораллиновых водорослей (ККВ). В исследовании изучались два типа камней при двух вариантах освещения (180 µmol m^-2 s^-1 и 80 µmol m^-2 s^-1); в результате были получены четыре варианта состояния камней. Первый тип живых камней – старые живые камни, предварительно очищенные и высушенные, без каких-либо следов морской жизни. Второй тип – такие же камни, но обрабатывавшиеся в системе с морской водой в течение трех месяцев при слабом освещении. В результате такой обработки на камнях появилась тонкая пленка из бактерий и зеленых водорослей. Вопрос стоял следующий: как предварительная обработка камней, в результате которой на камнях образовалась биопленка из морских водорослей, бактерий и прочих организмов, влияет на образование и рост ККВ в искусственных условиях? Результаты исследования проливают свет на процесс роста ККВ в искусственно созданных условиях, что поможет аквариумистам создавать условия для роста определенных типов необходимых корковых кораллиновых водорослей.

Материалы и методы

«Семенные камни»
Для засеивания экспериментальных камней корковыми кораллиновыми водорослями и другими организмами, около 250 кг живых камней находились одновременно в специальной системе. На камнях присутствовали розовые/фиолетовые и красные ККВ, а также плотные макроводоросли (Ulva sp.), жесткие кораллы (Porites sp.), отвердевающие макроводоросли (Halimeda sp.), полипы (Zoanthus sp.) и прочие неидентифицированные организмы. Камни были помещены в основную систему и в две 200-литровые системы, расположенные над основной. Возвратный насос мощностью 12 м3 час-1 (Aquamedic GmbH, Bissendorf, Germany) обеспечивал  постоянный обмен воды между основной системой и двумя дополнительными аквариумами.


Травоядные
С целью контроля роста корковых водорослей и макроводорослей, травоядные рыбы (Zebrasoma flavescens, Siganus guttatus и Ctenochaetus spp.), морские ежи (Diadema setosum, Echinometra mathaei) и улитки (Turbo sp., Trochus maculatus) обитали в основной системе и в 200-литровых аквариумах.

Экспериментальные камни
Сорок камней размером примерно 20 x 10 см были использованы для проведения эксперимента. Эти камни были случайно выбраны из группы камней, которые ранее были живыми камнями, но были тщательно очищены и затем в сухом виде хранились в течение нескольких лет. В этом случае сохранилась комплексная структура камней, но вся живность с них была удалена. Двадцать камней в течение 12 недель находились в системе с морской водой (см. ниже) при слабом освещении (интенсивность освещения составляла <50 µmol m^-2 s^-1); в результате на камнях появилась биопленка из бактерий, зеленых и коричневых водорослей, но практически не содержащая ККВ. Остальные двадцать камней хранились в темноте при комнатной температуре. В начале эксперимента все сорок камней были помещены в одинаковые условия, но при этом использовалось два вида освещения (см. Экспериментальный дизайн, фото 2 и 3).

Постановка эксперимента
После предварительной 12-недельной обработки, оба вида камней (обработанные камни с биопленкой и «голые» камни) были помещены в выше упомянутую систему, где им были созданы одинаковые условия. Каждая группа камней была разделена на две подгруппы, при этом, одна из них получала освещение 180 µmol m^-2 s^-1 , а другая - 80 µmol m^-2 s^-1; в результате получились четыре группы по 10 камней в каждой (N=10 в каждой группе). Получить два уровня освещенности удалось, расположив разные группы камней на двух уровнях от источников света. В каждой из четырех групп камни поворачивались дважды в неделю, чтобы сбалансировать освещенность и течение. Все камни были промаркированы наклейками и специальным цветовым кодом. Схема цветового кодирования была записана в начале эксперимента для последующего сравнения. На представленном ниже рисунке схематично представлено устройство экспериментальной системы:



Общие условия культивирования
Все камни, включая «семенные», были размещены в 15000-литровой системе. Фильтрация обеспечивалась 1000-литровым денитрификационным реактором (Dynamic Mineral Control или DyMiCo, US patent no. 6,830,681 B2, EcoDeco BV, Utrecht, The Netherlands). Реактор выводит неорганические питательные вещества и поставляет в систему кальций, магний и бикарбонат для поддержания качества воды.

Шесть светильников 300W Pro 300 Light Emitting Plasma (LEP) (Gavita Nederland BV, Aalsmeer, The Netherlands) использовались для получения равномерного освещения. Все камни были расположены на глубине примерно 20 см на сетке (AquaHolland, Dordrecht, The Netherlands). Освещенность измерялась на участках с интервалом в 20 см на глубине около 20 см при помощи квантового погружного датчика 192SA (LI-COR, Lincoln, USA), который измеряет фотосинтетически активное излучение (PAR, ~400-700 nm). Освещенность была установлена на уровне 180 µmol m^-2 s^-1 непосредственно под лампами (см. Постановка эксперимента).

Спектральные характеристики светильников LEP измерялись на участках с интервалом в 50 см на глубине примерно 20 см при помощи градуированного спектрометра Jaz (Ocean Optics, Dunedin, USA). Спектрометр был подключен к ноутбуку, где сохранялись полученные данные. Светильники LEP демонстрировали сбалансированный свет по всему видимому участку спектра, за исключением двух моментов уменьшения показателей, примерно 412 и 452 нм. Освещенность UV-A (315-400 нм) и инфракрасного света (>780 нм) также проверялась. При помощи таймера лампы включались в 07:45 и отключались в 20:30, соответственно, получилось соотношение света и темноты 12.75 : 11.25 часов. Эксперимент продолжался в течение 9 недель.


Качество воды проверялось на регулярной основе. Кальций, магний и щелочь титровались при помощи домашних тестовых комплектов (Salifert BV, Duiven, The Netherlands). Показатели аммиака-азота (NH3-N), нитратов-азота (NO3-N) и фосфатов-фосфора (PO4-P) измерялись при помощи Hach DR890 колориметра (Hach-Lange GmbH, Düsseldorf, Germany) в соответствии с инструкцией производителя.

Фотосъемка и анализ необработанных данных
Для измерения роста ККВ на экспериментальных камнях, каждый камень вынимался из системы и еженедельно фотографировался, с недели 0 до недели 9 (за исключением недели 1, в связи с временным ограничением) при стандартизированных настройках. Камера Canon PowerShot SX200 IS была установлена на штатив, который, в свою очередь, был расположен на плоском, черном столе. Каждый камень был расположен непосредственно под камерой, которая была направлена вниз. Рядом с камнями, в качестве шкалы, находилась линейка. Для улучшения четкости фотографий, использовался автоспуск с 2-секундной задержкой. Каждый раз использовалась вспышка. При этом, приближение (зум) не использовалось.


Все полученные снимки анализировались при помощи ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). При помощи линейки измерялась двухмерная область поверхности каждого камня, а также общая площадь поверхности ККВ на каждом камне, выраженная в см2. Простым подсчетом определялось количество колоний ККВ на каждом камне. Все данные вносились в Microsoft Excel и IBM SPSS для дальнейшего анализа. Рассчитывались следующие зависимые переменные: процентное содержание покрова ККВ, плотность колоний ККВ и размер колоний ККВ.

Статистический анализ
Нормальный характер данных оценивался посредством составления графика остаточных значений каждого набора данных в сравнении с прогностическими значениями, а также при помощи проведения теста Shapiro-Wilk. Гомогенность колебаний определялась при помощи теста Levene. В результате, все показатели были нормально распределены и продемонстрировали гомогенность колебаний после 10log преобразования (p>0.050). Двусторонний факторный анализ колебаний (ANOVA) использовался для определения основного и интерактивного влияния типа камней и освещенности на площадь покрова ККВ, плотность колоний ККВ и размер колоний ККВ. Простое сравнение использовалось для выяснения интерактивного влияния. Статистический анализ и графическое отображение проводились при помощи IBM SPSS Statistics 22 (IBM Corp., Armonk, USA). Все представленные значения представляют собой показатели ± стандартная ошибка (S.E.), если не указано другое.

Результаты

Площадь покрова розовых ККВ 
На всех камнях рост розовых ККВ был заметен в течение первых четырех недель. Площадь покрова розовых ККВ постоянно увеличивалась, достигнув 10.44% по прошествии 9 недель; при этом, самый активный рост наблюдался на изначально голых камнях при более интенсивном освещении (фото 6). Отмечалось существенное влияние типа камней на площадь покрова розовых ККВ (таблица 1); при этом, по прошествии 9 недель площадь покрова на изначально голых камнях была больше, чем на биологически обработанных. Влияние освещенности не было отмечено (таблица 1), однако, была замечена взаимосвязь между освещенностью и типом камней. Последующее сопоставление указывает на то, что по прошествии девяти недель площадь покрова розовых ККВ была больше на голых камнях по сравнению с обработанными камнями только в условиях более интенсивного освещения (F1,36=16.007, p=0.000). При менее интенсивном освещении существенных различий между типами камней не отмечалось (F1,36=2.327, p=0.136).


Площадь покрова красных ККВ 
По сравнению с розовыми ККВ, красным корковым кораллиновым водорослям потребовалось больше времени для роста (фото 7). Лишь на шестой неделе стал заметен рост красных корковых водорослей на всех типах камней. Покров красных ККВ постоянно увеличивался до 4.56% в течение девяти недель, при этом более активный рост отмечался на биологически обработанных камнях (фото 7). Было отмечено значительное влияние типа камней на площадь покрова красных ККВ (таблица 1), при этом, по прошествии девяти недель большая площадь отмечалась на предварительно обработанных камнях по сравнению с голыми камнями. Не было обнаружено ни прямое, ни интерактивное влияние степени освещенности (таблица 1).


Плотность розовых ККВ 
Плотность розовых ККВ активнее увеличивалась при более интенсивном освещении и стабилизировалась на разных уровнях в зависимости от обработки (фото 8). Наиболее высокая плотность отмечалась на изначально голых камнях при освещении 180 µmol m-2s-1, с показателем примерно 0.5 колоний на 1 см2 камня. Не было обнаружено существенного влияния типа камней на плотность розовых ККВ (таблица 1). Освещенность, однако, оказала значительное влияние на плотность розовых ККВ (таблица 1): плотность была выше при более интенсивном освещении. Никаких взаимосвязей и взаимозависимостей факторов не было обнаружено (таблица 1).


Плотность красных ККВ 
Плотность красных ККВ увеличивалась быстрее на биологически обработанных камнях (фото 9). Кроме того, по прошествии 9 недель более высокая плотность отмечалась при более интенсивном освещении. Было обнаружено влияние типа камней на плотность красных ККВ (таблица 1): более высокая плотность была отмечена на предварительно обработанных камнях. Помимо прочего, отмечалось существенное влияние освещенности (таблица 1): более высокая плотность была при освещении 180 µmol m^-2 s^-1 по сравнению с 80 µmol m^-2 s^-1. Не было обнаружено интерактивного влияния типа камней и освещенности на плотность красных ККВ (таблица 1).


Размер колоний розовых ККВ 
Размер колоний розовых ККВ наиболее заметно увеличился на изначально голых камнях (фото 10). По прошествии девяти недель было отмечено значительное влияние типа камней на размер колоний розовых ККВ(таблица 1): более крупные колонии были на изначально голых камнях. Ни основного, ни интерактивного влияния освещенности не было отмечено (таблица 1).


Размер колоний красных ККВ 
Размер колоний красных ККВ увеличивался быстрее на биологически обработанных камнях (фото 11). Несмотря на тот факт, что рост красных ККВ на изначально голых камнях начинался лишь спустя несколько недель по сравнению с обработанными камнями, спустя семь недель размер колоний был вполне сопоставим. По прошествии девяти недель не было отмечено значительного влияния типа камней на размер колоний красных ККВ (таблица 1). Было отмечено существенное негативное влияние освещенности (таблица 1): колонии достигали больших размеров при слабом освещении. Никакой взаимосвязи между типом камней и освещенностью не наблюдалось (таблица 1).


Фото 12 демонстрирует камни из всех четырех групп. Быстрорастущие зеленые водоросли первыми колонизировали камни. Рыбы-хирурги поддерживали камни чистыми от длинных дерновых водорослей и плотных макроводорослей, способствуя постепенному росту ККВ.


Таблица 1: Двусторонний факторный анализ ANOVA, демонстрирующий основное и интерактивное влияние типа камней и освещенности на площадь покрова ККВ, плотность колоний ККВ и размер колоний ККВ(N=10).


Качество воды
Качество воды в системе оставалось практически неизменным на протяжении всего эксперимента: с повышенными показателями концентрации щелочности, азота и фосфора по сравнению с естественными показателями.

Таблица 2: Качество воды в процессе эксперимента. Значения – показатель ±стандартное отклонение (N=8).

Обсуждение и выводы

Наше предварительное исследование свидетельствует о том, что первоначальное состояние камней влияет на рост ККВ при культивировании живых камней. Камни, на которых изначально не было биопленки из водорослей и бактерий, оказались более подходящими для роста розовых ККВ (при более интенсивном освещении), тогда как на обрабатывавшихся в течение 12 недель камнях быстрее росли красные ККВ. И хотя разница в показателях роста между типами камней кажется незначительной (т.е. красные ККВ начали расти на изначально голых камнях примерно на неделю позже, чем на обработанных камнях), результаты проливают свет на специфику роста и развития ККВ. Согласно нашим результатам, розовые ККВ быстрее колонизируют голый субстрат, чем субстрат с биопленкой. С другой стороны, красные ККВ, судя по всему, предпочитают биологически обработанные поверхности, поэтому им требуется больше времени для роста. Кроме того, красные ККВ растут медленнее, площадь их покрова по прошествии 9 недель составила всего 4.56% в сравнении с 10.44% покрова розовых ККВ.

Несмотря на то, что более высокая плотность колоний розовых и красных ККВ была получена при более интенсивном освещении, не было обнаружено существенного влияния освещенности на развитие покрова ККВ. Это открытие позволяет сделать вывод, что культивирование живых камней может быть более эффективным при низкой освещенности. Это очень важный аспект для разработки рентабельных и экономичных протоколов культивирования живых камней, поскольку помимо оплаты труда специалистов, электроэнергия – основная статья расходов.

Присутствие в системе травоядных рыб и морских ежей – важный аспект, который необходимо учитывать. Также как у коралловых рифов, рыбы-хирурги очищали камни от дерновых водорослей и плотных макроводорослей, способствуя росту ККВ. Без травоядных быстро бы выросли макроводоросли, которые, в свою очередь, затруднили бы рост ККВ (Belliveau and Paul 2002). Таким образом, полученные результаты применимы к системам, где обитает достаточное количество травоядных.


Несмотря на то, что все камни культивировались в одной системе, где находились одни и те же «семенные» камни, и химический состав воды был одинаковый, использовалась только одна система. Поэтому, камни не являются по-настоящему независимыми моделями эксперимента. Это понятие в науке известно как псевдо-повторность, а чтобы исправить этот аспект, необходимы, как минимум, три отдельные системы для культивирования. Результаты эксперимента в этих системах должны быть идентичными, что доказало бы воспроизводимость эксперимента. Однако, проведение такого эксперимента требует привлечения значительных ресурсов, что на данном этапе не представлялось возможным. Последующие эксперименты должны подтвердить воспроизводимость нашего предварительного эксперимента. В этом и заключается возможное участие аквариумистов, которые могли бы собрать большое количество данных из различных независимых систем.

Качество воды также могло повлиять на эксперимент, потому что содержание питательных веществ было выше, чем у естественных коралловых рифов. Поскольку на показатели роста ККВ мог негативно повлиять высокий уровень содержания питательных веществ (Belliveau and Paul 2002), наши результаты могут оказаться верными для эвтотрофных систем. В системах с меньшим содержанием нитратов и фосфатов рост ККВ может быть более активным.

Благодарность

Мы хотели бы выразить нашу благодарность Алко Нийсену из HZ University of Applied Sciences и Рональду Осинга из Wageningen University за их поддержку в проведении эксперимента.

Первоисточник: advancedaquarist.com           
Переведено специально для ReefCentral.ru           
Если вы увидели этот материал на другом сайте - значит, он был украден.           
Просим сообщать о замеченных фактах на info@reefcentral.ru